Gibson assembly

실험 공부!

 

1. 잡설

gibson assembly 방식은 DNA를 합치는 최고의 선택 중 하나다.

 

이름처럼 Daniel G. Gibson 아저씨가 만드신 이 kit는

infusion cloning같은 유사한 기술들이 존재하고 있지만 

들어가는 효소나 이렇건 달라도 그 기술을 사용하기 위한 우리의 준비물은 유사하기때문에

이 글에서는 단순히 디자인이 어떻게 되는지를 가볍게 다루려고한다.

 

어쨌든 DNA cloning을 위해 사용하는 기술이니까..

 

2. gibson assembly 왜 하지???

 

먼저 벡터 클로닝을 하고 싶다! 라는 목표를 기본으로 깔고 가겠다

 

이 기술은 클로닝 기법 중 하나기 때문에 플라스미드 DNA를 제작하는 데 유전자를 삽입, 교체하고 싶다는 목표는 명확하게 가져가자

 

gibson assembly는 간단하게 서로 겹치는 서열이 있다면 겹치는 서열을 토대로 두 서열을 이어주는 기능이다.

 

 

다 겹치는 서열이 있기만 하면된다는 뜻이다. (A는 DNA 둘 모두 겹치는 서열 존재, B는 insert에 vector 서열 존재, C는 vector에 insert 서열 존재)

 

 

조합은 T5 exonuclease, DNA ligase로 이루어져 있어서 굳이 kit가 아니라 enzyme을 직접 mix해서 쓸 수도 있다.

 

그럼 왜 gibson assembly로 클로닝을 해야하는가??

 

restriction-ligation, golden gate assembly, TA cloning는? 이라고 물어봤을 때,

 

할말은 없다. 다른 거 써도 된다, 효율도 난이도도 어떤 유전자 어떤 벡터를 다루고 있느냐에 따라 연구자마다 체감이 다르다.

 

그러나 gibson assembly와 그 유사한 kit들 (in-fusion 같은 것)들의 특징이 있다면

 

1. 제한효소 자리가 유전자 내부에 있는지 찾을 필요가 없다.

2. PCR만 가능하다면 디자인은 쉽다.

3. kit가 잘나와있고, 30분에서 1시간이면 쉽게 반응이 끝난다.

 

자세한 장점 단점은 kit 판매 페이지를 보면 도움이 될지도..?

 

3. 디자인 자세히!

 

디자인 방법은 다음과 같다.

 

1. 완성된 플라스미드의 형태를 먼저 디자인한다.

2. 완성된 플라스미드 맵이 그려졌다면 결합 부위를 중심으로 15 bp~40bp가 겹치도록 primer를 설계한다.

3. primer로 PCR을 진행하고 완성된 PCR fragment를 kit에 집어넣고 반응한다.

 

예시를 보자! 여기서는 위의 그림의 A에 해당하는 디자인을 보여주겠다!

 

5'-CCC...TTT-3' 라는 vector DNA가 있고,,

5'-GGG...AAA-3'라는 insert DNA가 있다고 하자

 

우리는 이 둘을 연결해서

 

5'-CCC...TTTGGG...AAA-3'

3'-GGG...AAACCC...TTT-5'

 

이라는 플라스미드 맵을 완성할 것이다.

 

(일반적으로 circular DNA로 만들것이기 때문에 DNA 맵 상에서 녹색과 검정색은 이어진다.)

 

그럼 이제 primer는 다음과 같이 필요하다.

vector DNA를 위한 primer 2개

insert DNA를 위한 primer 2개

그러니까..

 

Vector DNA의 primer 설계:

primer F: 5'-AAACCC-3'

primer R: 5'-CCCAAA-3'

 

Insert DNA의 primer 설계:

primer F : 5'-TTTGGG-3'

primer R : 5'-GGGTTT-3'

 

이걸로 PCR을 진행한다면..

 

Vector DNA의  PCR 결과물:

5'-AAACCC...TTTGGG-3'

3'-TTTGGG...AAACCC-5'

 

Insert DNA의  PCR 결과물:

5'-TTTGGG...AAACCC-3'

3'-AAACCC...TTTGGG-5'

 

두 PCR 결과물을 보면 앞뒤의 서열이 같은 서열을 공유하고 있다!

색상으로 구별이 쉽게끔 만들었다. 실제 ATGC에 정해진 색상은 아니다;;

 

자 그럼 설계는 끝났다 이제 두 PCR fragment를 넣고 반응한다.

 

추가로 설계는 3 PCR fragment 이상도 가능하니 이는 직접 설계해보면서 수행해보자.

 

일반적으로 fragment가 늘어날수록, 길이가 길어질수록 효율이 내려가니 적정한 컨디션은 논문을 참고하자

 

4. 반응 끝?

 

아쉬우니 몇가지 디테일을 더하자면

Volume: kit를 이용해서 kit manual대로 10 ul, 20 ul를 진행해도 되고 때에 따라 5 ul, 돈이 많으면 50 ul씩 해도 된다.

 

DNA preparation: PCR fragment는 PCR clean up을 수행하던 gel purification을 수행하던 해서 순도 높게 준비해주자

 

dpnI treatment: PCR product를 제외한 plasmid를 제거해주는 restriction enzyme을 처리해줘도 좋다!

(기호에 따라: gibson assembly 전에 각 PCR product를 dpnI 처리하자! / gibson assembly 후에 dpnI을 처리하자!)

 

temperature: 50도만 유지하면 되니까 heat block이던 PCR 기기던 상관없다.

 

E. coli TF: electrophoration용으로 바로 써도 되고, chemical transformation으로 진행해도 된다

 

그럼 이제 클로닝 벡터가 잘 확보되길 바란다.